Kiired, Kaasaskantavad Testid On Võrgus Koroonaviiruse Pandeemia Ohjeldamiseks

Kulleriga tarnitud testikomplektid ja digitaalsed tööriistad võitlevad COVID-19 puhanguga.

Singapuri, Taiwani ja Hongkongi erakordne edu ootamatu ägeda respiratoorse sündroomi koronaviirus-2 (SARS-CoV-2) mõju piiramisel näitab, et pandeemiaks valmisolekusse tehtavate suurte investeeringute abil on võimalik puhangule tõhusalt reageerida. Hoolimata Hiina lähedusest on need kolm piirkonda suutnud juhtumite arvu ja surmajuhtumeid madalal hoida. Õppides varasematest koronaviiruse puhangutest, kus need territooriumid kandsid suurt koormust, suutsid nad kiiresti rakendada laialdasi teste, kombineerida seda digitaalse jälgimisega inimeste liikumise jälgimiseks ja kehtestada kahtlastel juhtudel ranged karantiinid lisaks suurte isikukaitsevahendite varude loomisele. seadmed.

Ülejäänud maailmas pole enamik riike olnud viiruse rünnakuks täiesti valmis. Selle tulemusena on paljud tervishoiusüsteemid seisnud silmitsi kogukonna levikuga enne, kui isolatsiooni ja jälgimise võimaldamiseks on tehtud piisav testimine. Hoolimata rahvaterviseasutuste sageli drakoonilistest meetmetest ja isolatsioonitaktikatest tabati paljusid SARS-CoV-2 diagnostiliste testide valideerimisel, rakendamisel ja levitamisel ning detsentraliseeritud hoolduspunktide (POC) testimisel. Nüüd hakkab see pilt esimeste selliste testide saatmisega muutuma (tabel 1). Veelgi enam, praegune kriis võib olla määravaks hetkeks CRISPR-tehnoloogial põhineva diagnostika jaoks - esimene CRISPR-i geenide redigeerimise tehnoloogial põhinev diagnostiline test võib olla vaid nädalate kaugusel. Viiruse leviku peatamiseks tuleb aga teha suuri jõupingutusi hõlpsasti kasutatavate POC-testide tootmise laiendamiseks ja seejärel nende laialdaseks juurutamiseks.

Seni on SARS-CoV-2 puhangule esireaktsiooniks olnud polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) testimine. PCR on nakkusetekitaja diagnoosimise kullastandard ja selle eeliseks on see, et selliste testide jaoks vajalikke praimereid saab toota suhteliselt kiiresti, kui viirusjärjestus on teada. Esimesed kvantitatiivsed pöördtranskriptaasipõhised PCR (RT-PCR) testid SARS-CoV2 tuvastamiseks kavandasid ja levitasid jaanuaris Maailma Terviseorganisatsioon (WHO) kohe pärast viiruse tuvastamist. Katseprotokoll on siiski keeruline ja kallis ning sobib peamiselt suurtele tsentraliseeritud diagnostikalaboritele. Testide lõpuleviimine võtab tavaliselt 4–6 tundi, kuid kliiniliste proovide saatmise logistiline nõue tähendab, et pöördeaeg on parimal juhul 24 tundi. Ameerika Ühendriikides otsustasid USA haiguste tõrje keskused WHO testi asemel välja töötada omaenda testi. USA Toidu- ja Ravimiamet pani jalga, lubades rahvatervise või haigla laboritel katseid läbi viia, tõrge ühe reaktiivi puhul, mida kasutati esialgses RT-PCR-testis ja mille haiguste tõrje keskused töötasid välja ja levitasid veebruari alguses. ja RNA ekstraheerimisreagentide defitsiit on katse laiendamist üleriigiliselt edasi lükanud.

Nendele puudustele vaatamata jääb multipleksne RT-PCR, mis testib korraga mitut sihtjärjestust, eelkõige tsentraliseeritud laborites. Suured teenusepakkujad, nagu Roche Diagnostics, Thermo Fisher Scientific, Qiagen (varsti omandab Thermo Fisher) ja Quest Diagnostics, suurendavad selliste testide läbiviimise suutlikkust, käivitades SARS-CoV-2 automatiseeritud testimissüsteemid ja -teenused.

POC-teste on vaja ka kliiniliste otsuste tegemise kiirendamiseks ja osa töökoormuse eemaldamiseks tsentraliseeritud katselaboritest. Eelmisel kuul Genfis kokku kutsutud WHO eksperdirühm nimetas kogukonna tasandil kasutamiseks mõeldud kiired POC-testid kaheksaks teadustöö prioriteediks. Genfis asuv mittetulundusühing Foundation for Innovative New Diagnostics (FIND), mis toetab diagnostika väljatöötamist ja toimetamist madala sissetulekuga riikidesse, aitab seda laiaulatuslikku tegevust, kutsudes testi arendajaid esitama oma tooteid sõltumatule hindamisele. Sellele on laekunud 220 esildist, mida hinnatakse ja kvalifitseeruvate tootjatega võetakse ühendust selle kuu lõpuks. FIND on koostanud ka ulatusliku nimekirja SARS-CoV-2 diagnostilistest arendajatest, milles domineerivad ettevõtted, kes töötavad välja PCR-põhiseid nukleiinhappe tuvastamise teste või immunoteste. Singapuri Riikliku Ülikooli Saw Swee Hocki rahvatervise kool jälgib samuti tähelepanelikult diagnostika arengut nii äriettevõtetes kui ka akadeemilistes laborites.

Immuunanalüüsid võivad anda ajaloolist teavet viirusega kokkupuutumise kohta ja ka diagnostilisi tõendeid. Nad kasutavad antikeha-antigeeni äratundmist kas monoklonaalsete antikehade (mAb) abil viirusantigeenide tuvastamiseks kliinilistes proovides või kloonitud viirusantigeenide abil viiruse vastu suunatud patsiendi antikehade tuvastamiseks. Külgvoolu testi formaat - sisuliselt kassetti sisestatud mõõtevarras - sisaldab nii nitrotselluloosmembraanil kindlaksmääratud kohtades immobiliseeritud püüdmisreagente (kas viirusantigeenile suunatud mAb või viirusantigeen, mille tunneb ära patsiendi antikehad). märgistatud detektori mAb-dena, mis tunnevad ära sama sihtmärgi. Positiivne tulemus, mille käivitab seondumine analüüdi ja seonduva mAb vahel ning seondumine detektori mAb poolt, on nähtav värvilise joonena. Viiruse avastamiseks piisab kahest tilgast vereproovist. Need on sisuliselt samad kui kodused raseduskomplektid.

PCR ega immunotesti tehnoloogiad pole siiski ideaalsed. PCR-testid on ülitäpsed ja neid saab arendada kiirusega, kuid nende kasutamine on keeruline ja tulemuse saavutamiseks aeglane. Immuunanalüüsid on vähem täpsed ja nende väljatöötamine võtab kauem aega, kuid neid on lihtne kasutada ja need annavad tulemusi 20–60 minutiga. Kuna immuunanalüüsid tuvastavad patsiendi antikehad patogeeni suhtes, peavad need paratamatult võitlema inimese polüklonaalse antikeha vastuse olemusliku varieeruvusega. "Selle antikehareaktsiooni iseloomustamiseks on vaja aega," ütleb FIND teadusjuht Ranga Sampath. Seetõttu ei pruugi valideerimise käigus saadud tulemusi kliinilistes tingimustes tingimata korrata. "Need testid ei ole tavaliselt lõplikud - see on immunotestide suurim väljakutse," ütleb ta.

Isegi nii, et immunotestide kiirus ja mitmekülgsus muudavad need hindamatuteks testideks; ja jõupingutused nende massiliseks tootmiseks on hakanud jõudma. Taiwani Taipeis asuva Academia Sinica genoomika uurimiskeskuse teadur An-Suei Yang ja tema kolleegid väidavad, et on kõigepealt välja töötanud SARS-CoV-2 nukleokapsiidvalgu (N) vastase mAb, mis võiks olla aluseks antigeeni kiiretestist. Samuti on see genereerinud täiendavaid antikehi, mis tunnevad ära nii SARS-CoV-2 kui ka ainult SARS-CoV N algsed valgud või SARS-CoV N valgud. Ükski mAb-dest ei seondu teiste inimese koronaviiruse tüvede nukleokapsiidivalku. "Kui see on edukalt toodetud ja kinnitatud, suudab immuunpõhine kiirekatsekomplekt tuvastada koroonaviiruse antigeeni ainult 20 minuti jooksul ilma instrumentide ja väljaõppinud töötajateta, mis tooks kaasa gripi kiire LFIA [lateraalse voolu immunotesti] testi ja kasulikkuse," ütleb ta. Yangi grupp saavutas mängu vaid 19 päevaga, tehes tööd antikeha ja antigeeni vastasmõjude tehisintellekti mudelitega, mida nad kasutasid kunstlike antikehade raamatukogude loomiseks. Prognoositud antikeha DNA-d saab keemiliselt sünteesida ja saadud mAb-sid ekspresseerida bakterite faagi kuvamise süsteemides. Loomade immuniseerimisest hoidumine monoklonaalsete antikehade saamiseks, mis seejärel tuleb sidumisaktiivsuse jaoks sorteerida - traditsiooniline meetod - raseerib umbes kaks kuud tavapärasest ajakavast. Rühm töötab nüüd LFIA seadme prototüübi kallal, kuid soovib antikehapaneeli litsentseerida ka kolmandatele isikutele.

Immuunanalüüsi jaoks on Nova Scotias asuv Sona Nanotech Halifax valinud teravikuvalgu SARS-CoV-2 S1 domeeni antigeenipõhise LFIA aluseks, mida ta arendab koostöös GE Healthcare Life Sciencesiga. Spike (S) valk hõlbustab viiruse sisenemist hingamisteede epiteelirakkudesse, sidudes nende pinnal ekspresseeritud angiotensiini konverteeriva ensüümi 2 (ACE2). "Eeldame, et järgmise kuue kuni kaheksa nädala jooksul on saadaval ainult teadusuuringuteks mõeldud toode," ütleb tegevjuht Darren Rowles. Peale selle plaanib ettevõte välja töötada ka järgmise põhjapoolkera gripihooaja jaoks topelttoote, mis ühendaks SARS-CoV-2 ja gripiviiruse tuvastamise ühe testina.

Registreeru Scientific American tasuta infolehtedele.

Testid SARS-CoV-2 vastaste polüklonaalsete antikehade tuvastamiseks on kiiremini välja töötatavad kui viiruse enda tuvastamise testid, kuna need sisaldavad ainult immobiliseeritud rekombinantse viiruse antigeeni (mida on palju lihtsam tekitada kui viiruse vastaseid mAb-sid). Need pakuvad ka mAb-põhiste testidega sarnast täpsust.

Berliinis asuv Pharmact on juba alustanud 20-minutilise immunotesti tarnimist, mis sisaldab kolme SARS-CoV-2 antigeeni: N-valku ning S-valgu S1 ja S2 domeene. See on mõeldud kõigi valgu struktuuride tuvastavate patsiendi antikehade tuvastamiseks. Selle eesmärk on suurendada tootmist aprillis ühe miljoni katseni. Nagu sellisele testile tüüpiline, tuvastab see nii immunoglobuliini (Ig) M kui ka IgG antikehad, mis vabanevad vastavalt nakkuse alg- ja hilisemas staadiumis. Ta on läbi viinud valideerimisuuringud, milles võrreldi tema testi PCR-iga, kasutades 114 nakatunud patsiendi proove ja 126 nakatamata kontrolli. Testi spetsiifilisus oli kõrge. "Meil oli tõeline negatiivne protsent 100% nullist valepositiivset," ütleb Pharmacti meditsiinidirektor Gunther Burgard. Selle tundlikkus oli siiski väiksem, kuna IgM vastus ei paku tugevat algsignaali. Infektsiooni varases staadiumis (4. – 10. Päev) annab testi IgM komponent tundlikkuse vaid 70%. See tõuseb 11. ja 24. päeva vahel kiiresti 92,3% -ni ning testi IgG komponent pakub nakkuse selles faasis tundlikkust 98,6%. Üldiselt on testi vale negatiivne määr 13%, ütleb Burgard.

Detsentraliseeritud testide integreerimine epidemioloogilise seirega tugevdaks veelgi SARS-CoV-2 puhanguga võitlevate rahvatervise asutuste kätt. Washingtoni ülikooli juhitud Seattle'i gripiuuring kohandab praeguse kriisiga uuenduslikku lähenemisviisi hooajaliste gripipuhangute jälgimiseks kogu linnas. Osalejad, kellel tekivad hingamisteede sümptomid, saavad elektrooniliselt taotleda nina-tampoonikomplekti, mille toimetab kohale kuller. Värbamine, nõusolek ja andmete kogumine toimub kõik elektrooniliselt, kuid protokoll tugineb tsentraliseeritud laboratoorsetele katsetele, mitte POC-testidele. Soomes näitas uuring, et epidemioloogilist seiret on võimalik saada reaalajas, integreerides automatiseeritud POC-testid laboratoorsete infosüsteemidega. Soomes asuva ArcDia Turu välja töötatud POC-süsteem mariPOC Respi edastab nüüd andmeid pilve kaudu. Praegu hõlmab see üksteist hingamisteede patogeeni, sealhulgas kümmet viirust (nende hulgas koroonaviirus OC43, üks kolmest inimese keronaviirusest, mis põhjustavad ainult kerget haigust) ja ühte bakteriliiki. Ettevõte kavatseb nüüd paari kuu jooksul kaasata SARS-CoV-2 nende paneeli. MariPOC Respi süsteem ei ole suure läbilaskevõimega seade: see tugineb ülaltoodud analüsaatorile, mis suudab päevas töödelda umbes sada proovi, kuid reaktiivikulud on umbes kolmandik PCR-testimisega seotud kuludest. Seda pakutakse kogukondlikes keskkondades, näiteks suurtes esmatasandi arstiabikeskustes. Ehkki selle turuosa on Soomes 50%, on mujal kasutuselevõtt seni olnud piiratud. "Põhilaborid eelistavad multipleksset PCR-i," ütleb Aleksi Soini, ArcDia strateegia- ja äriarenduse asepresident. Nende asutuste juhid on diagnostikas arvamusliidrid ja ei soovi oma võimust detsentraliseeritud testimisrežiimidele loobuda. "See on struktuurne küsimus," ütleb Soini. Scanwell Health valmistub käivitama veelgi detsentraliseerituma testi - kodus pakutava immuunanalüüsi ja sellega kaasneva nutitelefoni rakenduse, mis võimaldab kasutajatel tulemust jagada arsti või meditsiiniõega. See on saanud USA õigused Tangshani, Hiinas asuva Innovita Biological Technology antikehapõhise immunotesti jaoks (tabel 1).

PCR põhineb muidugi teadusel, mis on nüüd juba mitu aastakümmet vana. CRISPR-i pioneeride Jennifer Doudna ja Feng Zhangi asutatavate ettevõtete Mammoth Biosciences ja Sherlock Biosciences eesmärk on mõlemad viia selle täpsus vastavusse, saavutades samas ehtsad POC-testimiskiirused, kasutades CRISPR-Cas-i redigeerimise eripära ja tundlikkust POC SARS-CoV- 2 testi. Mammutiteadlased koos San Francisco California ülikooli ja California rahvatervise osakonna kaastöötajatega teatasid hiljuti SARS-CoV-2 DETECTRi - külgvoolu testi, mille teostamiseks kulub 30 minutit - kavandamisest ja toimimisest. või umbes 45 minutit, kaasa arvatud RNA ekstraheerimise etapp. Test kasutab viiruse RNA samaaegset pöördtranskriptsiooni ja silmusega vahendatud amplifikatsiooni - lihtsustatud nukleiinhappe amplifikatsiooni tehnikat, mis kasutab PCR-stiilis praimereid, kuid mis ei nõua korduvaid kuumutamise ja jahutamise tsükleid. Seejärel inkubeeritakse amplifitseeritud nukleiinhapet SARS-CoV-2 ja ensüümi lbCas12a ümbrise (E) ja N geeni suunavate RNA (gRNA) molekuli suunavate järjestustega, mis pärast gRNA vahendatud sihtkohta tuvastamist lõhustuvad läheduses üheahelaline DNA (ssDNA) valimatult. See võimaldab lisada ssDNA-l põhinevaid reportermolekule, mis kinnitavad viiruse RNA olemasolu.

Vastavalt esialgsele valideerimistestile RT-PCR-i abil, kasutades 6 SARS-CoV-2-ga nakatunud patsiendi, 12 hooajalise gripi või kolme kerget sümptomeid põhjustava koroonaviiruse tüve (OC43, HKU1 ja NL63) nakatunud patsiendi ning 5 terve patsiendi proove vabatahtlikel oli testi positiivne prognoosiväärtus 100% ja negatiivne 91,7%. "Oleme täiendava valideerimise keskel," ütleb Mammothi asutaja ja tegevjuht Trevor Martin. Ettevõtte eesmärk on saata test võimalikult kiiresti. "Ideaalse stsenaariumi korral on nädalad, mitte kuud," ütleb ta. See oli kavandatud lihtsustatud reaktiividega, et hõlpsasti valmistada. "Kasutatavas pole midagi liiga eksootilist, välja arvatud CRISPR-valk ise," ütleb ta. Reagentide lüofiliseerimine ja kaasaskantavate mikrofluidikassettide väljatöötamine katse läbiviimiseks võimaldaks seda rakendada väljaspool laboriseadeid.

Sherlock Biosciences töötab ka mitme SARS-CoV-2 algatuse kallal. "Üks asi on kiiresti kasutusele võetud tehnoloogia," ütleb Sherlocki tegevjuht ja kaasasutaja Rahul Dhanda, kuid "analüüsi turuletoomine nõuab palju enamat kui testi töötamine." Ettevõtte eesmärk on kasutada partnereid, et pääseda juurde nende regulatiivsetele teadmistele ning tootmise ja turustamise lihastele. See on sõlminud Cepheidiga liidu, et töötada välja CRISPR-põhised testid mitmesuguste nakkushaiguste, sealhulgas COVID-19 jaoks, mis töötavad viimase ettevõtte automatiseeritud molekulaardiagnostikasüsteemides GeneXpert. Suhete üle arutati juba enne praeguse kriisi puhkemist, kuid SARS-CoV-2 kaasamine oli ilmne samm. Arvestades praeguse kriisi pakilisust, uurib Sherlock ka seda, kas see võib tuua turule lihtsama testi lühema aja jooksul. "Hakkasime suhtlema komplektide tootjatega, et teha kindlaks, kas saaksime komplekti kokku panna," ütleb Dhanda. "Seal on terav reageerimine ja kõikehõlmav vastus, millele me kõik peame mõtlema."

Arvestades praeguse pandeemia trajektooriga seotud ebakindlust, on ebaselge, kas CRISPR-tehnoloogia annab olulise panuse ülemaailmsetesse jõupingutustesse SARS-CoV-2 arengu jälgimiseks. Kuid vajadus sellise tehnoloogia järele näib pakiline. "See on molekulaarse diagnostika turul paljastanud suure lõhe," ütleb Martin. See on vaid üks paljudest lünkadest enamikus riikides viirusepandeemiaks valmisolekus.

Lisateavet koronaviiruse puhangu kohta leiate siit.