Kuidas Ma Korporatsiooni Scientific American Jaoks Koronaviiruse 3-D Mudeli Ehitasin

SARS-CoV-2 molekulaarse detaili renderdamine nõudis uurimistöö, hüpoteesi ja kunstilise litsentsi kombinatsiooni.

Kuidas näeb välja COVID-19 põhjustav viirus SARS-CoV-2 ?.

Sellel lihtsal küsimusel pole lihtsat vastust. SARS-CoV-2 on väga väike ja selle nägemine nõuab spetsialiseeritud teaduslikke tehnikaid. Elektronmikroskoopia (EM) võib paljastada selle üldise suuruse ja kuju. Näeme, et virionid on sfäärilised või ellipsoidsed, nende pinnal on naastude “kroonid”. Virioni paljude eksemplaride hoolika krüoelektronmikroskoopia (krüo-EM) uuringu tulemusel saab täpsemalt mõõta viirust ja selle suuremaid tükke. Neid üksikuid tükke saab uurida viirusest eraldi, kasutades krüo-EM, röntgenkristallograafiat või NMR spektroskoopiat, mille tulemuseks on aatom- või aatomilähedased 3D-mudelid.

Kuid painduvad ja korrastamata osad võivad nendest tehnikatest kõrvale hiilida, jättes hallid alad ja ebaselguse.

Sellise täieliku viiruse nagu SARS-CoV-2 3-D mudeli ehitamine molekulaarselt üksikasjalikult nõuab uurimistöö, hüpoteesi ja kunstilise litsentsi kombinatsiooni. Mõned struktuurid on teada, teised on mõnevõrra tuntud ja teised võivad olla täiesti tundmatud.

Kui ma ehitasin Scientific American'i juulinumbris näidatud mudelit, oli mitu kohta, kus pidin olemasolevate tõendite põhjal tegema parimaid otsuseid. See mudel pole täiuslik; kui teaduslik arusaam SARS-CoV-2-st areneb, võib kahtlemata vajada selle osade ajakohastamist.

Paljud uuringud, millel see mudel põhineb, tehti SARS-CoV, koroonaviiruse, mis põhjustas 2003. aastal haiguspuhangu nime all SARS. SARS-CoV on tihedalt seotud SARS-CoV-2-ga ja on struktuurilt väga sarnane. Nende põhjustatud haiguste erinevused tulenevad tõenäoliselt väga väikestest molekulaarsetest tunnustest, mis virioni kui tervikut vaadates oleksid vaevu nähtavad. Otsustasin kohe alguses kasutada SARS-CoV andmeid vastavalt vajadusele. SARS-CoV-2 uuringud on endiselt pooleli ja SARS-CoV kohta tehtud väga hoolikad ultrastruktuuriuuringud tuleb SARS-CoV-2 osas veel teha.

Siinkohal tutvun virioni iga komponendiga ja vaatan läbi tõendid, mille leidsin selle struktuuri kohta ja kus pidin hüpoteeside või kunstilitsentsiga lüngad ületama.

ÜLDINE STRUKTUUR

Elektronmikroskoobi all näevad SARS-CoV-2 virionid välja kerajad või ellipsoidsed. Teadlased on mõõtnud läbimõõtu 60–140 nanomeetrit (nm). (See on umbes üks tuhandik juuksekarva inimese juustest). Selle mudeli ehitamise ajal olid saadaval mõõtmised negatiivse plekiga elektronmikroskoopia abil, mis ei lahenda üksikasju nii hästi kui krüo-EM.

Täpsemate mõõtmiste tegemiseks viitasin SARS-CoV üksikasjalikult üksikasjalikule krüo-EM uuringule aastast 2006. Seal teatasid teadlased, et keskmised läbimõõdud olid 82 kuni 94 nm, välja arvatud naelu. Lõpuks ehitasin oma virioni mudeli sfääriliseks ja 88 nm läbimõõduga. Selles uuringus teatati ka struktuurivalkude suhtelisest kogusest pinnal; kõiki neid mõõtmisi koos kõnealuse valguga kirjeldatakse allpool.

SPIKE (T) VALK

Piigi (S) valk jääb viirusepinnalt välja ja võimaldab sellel inimese rakkudele kinnituda ja nendega sulanduda. Naelu ülaosa, sealhulgas kinnitusdomeen ja osa termotuumasünteesimasinatest, olid krüo-EM abil 3D-kaardistatud kahe uurimisrühma (Veesler Lab ja McClellan Lab) poolt 2020. aasta märtsiks. piiki, transmembraanset domeeni ja virioni sees olevat saba ei kaardistata. Teadlased teavad, et need piirkonnad on olemas ja milliseid aminohappeid (valgu ehitusplokke) need sisaldavad, kuid pole veel suutnud jälgida nende paigutust 3D-ruumis.

Tüve lisamine on peamine erinevus minu mudeli ja paljude SARS-CoV-2 visualiseerimiste vahel. Enamik, kaasa arvatud ikooniline CDC pilt, kasutavad teraviku ülaosas 3D-andmeid, kuid ei näita tüve, mille tulemuseks on lühem piigimudel.

Alguses modelleerisin skemaatilist tüve, nii et piik sarnanes veidi kivikommi pulgakommiga. Sobitasin selle SARS-CoV mõõdetud piigi kõrgusele ja kaugusele, umbes 19 nm pikkused ja 13–15 nm kaugusel.

Kuid teaduse Twitteris olin näinud Lorenzo Casalino, Zied Gaiebi ja Rommie Amaro postitusi California ülikoolist (San Diego), mis näitasid piigi ja sellega seotud suhkrukettide molekulaardünaamika videot. Nad olid loonud täieliku piigimudeli, mis sisaldas tüve, membraanidevahelist domeeni ja saba, tuginedes aminohapete järjestuse sarnasusele tuntud 3D-struktuuridega. See mudel oli vajalik nende molekulaarse dünaamika uuringuks (nüüd juba eeltrükis), et saada lisateavet piigi käitumise kohta. Nad jagasid minuga heldelt oma mudelit, et see minu visualiseerimisse kaasataks.

Nimelt on Amaro laborimudel 25 nm pikk, 6 nm pikem, kui ma SARS-CoV mõõtmiste põhjal ootasin. Ma ei lahendanud seda lahknevust, kuid minu hüpotees on see, et tegelike virionide korral teravikud varred painduvad ja tunduvad elektronmikroskoobi all lühemad ja / või naelu ülemise osa paindlikkus hägustab selle piire, mis muudab kõrguse mõõtmise mõneti kahemõtteline isegi krüo-EMi poolt.

Samuti on teatatud SARS-CoV-2 naelu 9–12 nm kõrguse mõõtmine negatiivse plekiga EM pildi põhjal. Negatiivse plekiga EM ei lahenda siiski detaile nii hästi kui krüo-EM, mida kasutati 19 nm mõõtmise tegemisel. SARS-CoV-2 piigis on ka sarnane arv aminohappeid kui SARS-CoV piigis (1, 273 versus 1, 255), seega on väga ebatõenäoline, et SARS-CoV-2 piik oleks nii väike kui need negatiivsed plekid põhinevad mõõtmised näitavad.

LIIKME (M) VALK

Membraani (M) valk on väike, kuid rohke valk, mis on varjatud viiruse ümbrisesse, kusjuures viiruse sees on saba, mis arvatavasti suhtleb N-valguga (kirjeldatud allpool). Nagu piigitüve, pole ka M-valku kaardistatud 3-D-s ega ühtegi sarnast valku. SARS-CoV ja SARS-CoV-2 M valgud on suuruselt sarnased (vastavalt 221 ja 222 aminohapet) ning aminohapete mustri põhjal oletavad teadlased, et väike osa M eksponeeritakse viiruse välisküljel membraan, osa sellest on membraanis ja pool on viiruse sees. Selle teabe põhjal panin kokku mudeli, mis põhines osadel kahest veidi sarnasest valgust (Proteiini andmepanga kanded 4NV4 ja 5CTG, mille tuvastab SwissProt). Intraviiruse domeeni mudelil oli pikk saba, kuid ma ei suutnud seda enesekindlalt orienteeruda ja leidsin, et see on juhitud paarituid suundi, nii et lõikasin selle ära, et vältida visuaalset tähelepanu hajumist või vale struktuurse tunnuse olemasolu.

M-valgud moodustavad paarid ja arvatakse, et viiruse pinnal on ühe naelu kohta 16–25 M-valku. Lõppkokkuvõttes modelleerisin oma mudelis 10 M valgu paari (seega 20 M valku) naelu kohta. Mõned teadlased oletavad, et M-valgud moodustavad ümbrises võre (suheldes N-valgu aluseks oleva võrega; vt allpool). Selle hüpoteesi vihjeks otsustasin kasutada M-valgu dimeeride korrapärase jaotuse loomiseks ikosaedrilist sfääri.

N VALK

Nukleoproteiin (N-valk) on pakitud virioni sisse koos RNA genoomiga. Arvatakse, et see moodustab võre moodi struktuuri vahetult ümbrise all ja viiruse naelu mahub ainult N valgu vahele, takistades nende paigutamist lähemale kui 13–15 nm.

N-valk on valmistatud kahest suhteliselt jäigast kerakujulisest domeenist, mis on ühendatud pika korrastamata linkerpiirkonnaga. Kahe domeeni, NTD ja CTD, struktuurid on teada vastavalt SARS-CoV-2 ja SARS-CoV, kuid see, kuidas nad täpselt üksteise suhtes orienteeruvad, on natuke mõistatuslik. Linkiva domeeni häire põhjal võib see olla väga varieeruv.

CTD struktuur määrati röntgenkristallograafia abil, mis nõuab valgu puhastatud koopiate kristallimist. Selles kristallimisprotsessis moodustas CTD huvitava kaheksaosalise struktuuri, mis virnastatuna moodustab spiraalse südamiku. See ei ole lõplik, kuid viitab sellele, et viiruslik RNA võiks selle südamiku ümber mähkida. N-valgu teine pool, NTD, võib seejärel suhelda RNA välisküljel või kinnitada selle asemel, kui see on M-valgu ja viiruse ümbrise lähedal. See moodustaks vaadeldava N-ümbrise valgu võre ja hoiaks kogu RNA-N valgu kompleksi võimaluse korral membraani lähedal.

Sadade N-valgu eksemplaride modelleerimise tehniline väljakutse, millest mõlemal on kaks domeeni, mis on seotud häiritud aminohapete ahelatega, oli selle mudeli loomisel liiga suur. Otsustasin paigutada NTD võre viiruspiikide alla, ehitada RNA-N valgu kompleksi jaoks spiraalsete CTD-de tuum ja lisada NTD-d, mis suhtlevad nii RNA-ga kui hajuvad kogu virionis. Jätkasin südamiku spiraali viiruse keskpunkti; see oli minu lahendus ülipika RNA ahela pakkimiseks (rohkem allpool), kuid tegelikult võivad RNA ja N valk olla virioni keskosas rohkem häiritud. Lõpptulemus haarab mõned ideed, kuidas N-valk on sisse pakitud, kui mitte selle täielik ja dünaamiline keerukus.

RNA

29, 903 RNA aluse juures on SARS-CoV-2 genoom sarnaste viirustega võrreldes väga pikk. Tahtsin veenduda, et minu RNA mudel oleks ligilähedane genoomi pikkusega. Kuid RNA struktuur võib olla keeruline; mõnes piirkonnas võivad alused suhelda teistega, moodustades aasad ja juuksenõelad ning tulemuseks väga keerdunud 3-D kujundid. Selle mudeli puhul eeldasin, et RNA oli väljavenitatud niit, mis oli kogu pikkuses kenasti ümber N-valgu südamiku. Leidsin 1980. aastast pärit uurimistöö, milles esitati virioni ristlõikega modelleeritud poole genoomi kohta 4–4,8 RNA aluse nm kohta ehk umbes 3 000–3 750 nm mõõtmised.

Algul, kui selle arvutuse tegin, jäin töölt välja järjekorraga 10. 300 nm RNA virionisse sobitamine oli imelihtne! Berkeley California ülikooli viroloog Britt Glaunsinger, kes oli projekti konsultant, märkis selle läbivaatamisel, et RNA-d peaks olema rohkem, ja ma vaatasin oma arvutused uuesti läbi ja tabasin oma vea. Mul oli vaja pigistada virioni ristlõikes 80 nm laiusesse ruumi vähemalt 3 000 nm; selleks kulus veel natuke 3D-finaglingut. Kui mul perifeeria lähedal ruumi otsa sai, jätkasin RNA ja N valgu spiraali virioni keskele.

E VALK

Ümbrisvalk (E) on viiekordne sümmeetriline molekul, mis moodustab viiruse membraanis poorid. Paljud koopiad tehakse viiruse replikatsiooni käigus rakus, kuid väga vähesed on ühendatud küpsetesse virionidesse. Teadlased ei ole veel kaardistanud 3-D valku SARS-CoV-2 E, kuid on olemas eksperimentaalselt tuletatud SARS-CoV E valgu mudel, mis on umbes 91 protsenti sarnane. Kasutasin siin seda mudelit.

Ümbrik

SARS-CoV-2 on ümbritsetud lipiidide kahekihiga, mis pärineb peremeesrakus asuvatest organellimembraanidest (täpsemalt endoplasmaatiline retikulum ja Golgi aparaat). Ma esindasin seda üldiste lipiididega: üks pea kahe sabaga. Rohkemate aegadega oleks see võinud olla üksikasjalikum. On palju erinevaid lipiide, mille proportsioonid on omased päritolumembraanile.

TUUME KÕIK KOOS

TUGEV SKETS JA ALGNE 3-D MUDEL

Pärast virioni kiire käsitsi visandiga sisselogimist, et tagada kõigi vajalike üksikasjade lisamine, hakkasin samaaegselt 3D-mudeli uurimist ja ehitamist 3D-modelleerimis- ja animatsiooniprogrammis Cinema4D. Cinema4D-s lõin baasina 88 nm kera ja seejärel sihtisin molekulaarsete mudelite koopiaid kas selle pinnale või selle sisse. Uurimise edenedes muutsin nende jaotust ning loendasin, mõõtsin ja arvutasin vastavalt vajadusele. Kasutan manustatud Python Molecular Vieweri (ePMV) pistikprogrammi saadaolevate 3D-molekulaarsete andmete importimiseks otse.

ALGVÄRVI UURING

Värvide katsetamiseks kasutasin saadud mudeli põhilist 2-D pilti ja kasutasin seda paletti lähtepunktina oma materjalide loomisel ja 3D-valgustuse seadistamisel.

3-D VÄRVI UURINGUD

Esialgu kujutasin ette sooja, roosakat tausta, otsekui vaataksin lähedalt võimatult hästi valgustatud inimkoe nurka. Siiski katsetasin 2-D-s tumedama jahedama taustaga ning leidsin, et mulle meeldis, kuidas see piikvalkude võra popiks tegi. Ka kunstijuht Jen Christiansenile meeldis see suund, nii et viimistlesin tumedama taustavariandi illustratsiooniks, mis leiti Scientific Americani 2020. aasta juuli kaanelt.

Tänusõnad.

Tahaksin tunnustada ja tänada oma eakaaslasi Meditsiiniliste Illustratorite Assotsiatsioonis (AMI) nende uurimistöö jagamise eest Michael Konomose eestvedamisel. Aitäh ka Nick Woolridge'ile, David Goodsellile, Melanie Connollyle, Joel Dubinile, Andy Leftonile, Gloria Fuentesele ja Jennifer Fairmanile kirjavahetuse ja visualiseerimise eest, mis aitasid minu enda arusaamist SARS-CoV-2-st veelgi aidata. Aitäh Scientific American’i Jen Christiansenile kunsti juhtimise eest ja paljude nende sügavate nohikute e-kirjade hüüdmise eest, mille ma talle selle teose tegemise ajal saatsin.